K akci se připojí 61 muzeí, galerií, památek a dalších kulturních institucí, většinu z nich mohou lidé navštívit zdarma. Muzejní noc začíná v 19:00 a potrvá do půlnoci. Přesné informace včetně seznamu všech zapojených organizací jsou na webu muzejní noci. Návštěvníci mohou k přepravě mezi nimi využít čtyři speciální linky MHD.

Během akce se mimořádně otevře hlavní budova Muzea Prahy, která je od roku 2020 uzavřena kvůli rekonstrukci. Objekt je už opraven, nová expozice v něm zatím není. Výstavní prostory proto na jednu noc zaplní díla studentů ateliéru Intermédia 1 Akademie výtvarných umění (AVU). Před hlavní budovou Muzea Prahy na Florenci bude také doprovodný program. Nabídne aktivity pro děti, hudební vystoupení, food tracky a při vhodném počasí také desetimetrový nafukovací model měsíce. Muzeu ho zapůjčí Hvězdárna a planetárium Brno.

Pražský dopravní podnik vypraví speciální muzejní linky, tři tramvajové a jednu autobusovou. Číslo 33 bude jezdit mezi Hlubočepy a Náměstím Bratří Synků, číslo 34 mezi Královkou a Výstavištěm, číslo 35 mezi Strossmayerovým náměstím a Špejcharem a číslo 888 pojede po trase Špejchar, Malostranská, Staroměstská, Náměstí Republiky, Florenc, Hlavní nádraží, Muzeum, I. P. Pavlova, Vyšehrad a zpět. V provozu budou od 19:00 do 24:00 hodin, platí na nich běžný tarif Pražské integrované dopravy.

První ročník Pražské muzejní noci se uskutečnil v roce 2004, akce byly velice oblíbené, návštěvnost v některých ročnících dosahovala ke 200.000 lidí. Sérii přerušila pandemie onemocnění covid-19. Tradici obnovilo Muzeum Prahy v minulém roce, kdy se dohodlo s Národním muzeem na poskytnutí ochranné známky a konceptu Pražské muzejní noci. K akci se loni připojilo asi 30 institucí, které navštívilo dohromady 35.000 lidí.